CRISPR/Cas9基因编辑技术如今已在生物医学研究领域带来了革命性的影响。通过对基因进行敲除、敲入、转录激活或抑制，这一技术广泛应用于从研究细胞和动物模型中的基因功能，到改良农作物基因，再到开发治疗人类遗传性疾病的基因疗法等多个方面。CRISPR基因编辑的相关组分能够通过病毒性和非病毒性两种方式递送至靶细胞，本文将重点探讨多种非病毒基因递送系统的特点，以及其在不同实验中的应用关键要点。

质粒DNA递送系统

质粒DNA递送系统是一种引入外源遗传物质最简单且最经济的方法，通常通过直接转染质粒DNA（pDNA）实现。一个质粒载体能够同时携带Cas9核酸酶和gRNA的编码序列，或者使用两个质粒各自承担这两种组分。其特点在于DNA固有的稳定性，能够实现较长时间而稳定的转基因表达。特别是在靶点位于高度压缩的高级染色质结构时，较慢而持久的CRISPR组分表达能够更有效地到达靶位点。然而，这也伴随了非靶位点切割风险的增加，从而导致显著的脱靶效应。此外，质粒DNA还有可能整合入宿主基因组中，造成插入突变。

为了降低脱靶效应，使用质粒递送系统时可以考虑对Cas9进行额外的修饰，比如偶联降解信号序列或抑制结构域，或者采用诱导表达系统来控制CRISPR组分的表达。常用的诱导表达系统包括四环素响应元件（TRE）启动子，当四环素或其类似物（如多西环素）存在时，该系统会被激活。若需在同种细胞中多次编辑，建议采用带有四环素诱导Cas9表达的细胞稳转株，以最小化背景编辑并实现持续的基因编辑效果。

尽管质粒生产简单且易于放大规模，但在制备过程中存在内毒素污染风险，一些为细菌扩增设计的序列可能引发宿主免疫反应。为此，可以考虑采用微环质粒DNA骨架（如miniVec®），以减少与细菌序列相关的元件。

RNA递送系统

相比质粒递送，RNA递送系统以RNA形式（如Cas9 mRNA和gRNA）送入细胞更为高效，直接启用Cas9的翻译。这种方法特别适合短期实验，因为RNA具有内在的不稳定性，快速降解使得CRISPR组分表达较短，降低了长时间表达所导致的脱靶效应，且相较于质粒DNA的插入突变风险来说更为安全。mRNA的生产可在体外以无细胞方式进行，减少了污染风险。然而，RNA的制造成本较高，工艺复杂，批量生产也面临挑战。

与质粒相似，mRNA也可通过显微注射、电穿孔或脂质纳米颗粒（LNP）送入细胞中。尤其是基于LNP的递送，已被证明在治疗性RNA中是一种有效方法，如辉瑞和莫德纳的COVID-19疫苗。预计未来使用mRNA LNP的CRISPR疗法将会在针对治疗甲状腺素淀粉样变性（ATTR）的临床试验中得到进一步展现。

核糖核蛋白复合体（RNP）递送系统

当前非病毒递送方法中，使用核糖核蛋白复合体（RNP）是递送CRISPR组分效率最高的方式。由于RNP无需经过转录和翻译，Cas9蛋白和gRNA能够立即进入细胞核，从而迅速启动基因编辑。与RNA相同，此方法同样避免了外源基因整合至宿主基因组的风险，其CRISPR组分表达较短，有助于减少脱靶效应。然而，RNP易被蛋白酶降解，在使用和储存时对条件有更高要求，特别是在临床环境中。此外，与pDNA和mRNA相比，RNP的生产需要更高的人力成本，且在生产过程中引入有毒污染物的可能性增加，为临床应用带来安全风险。

电穿孔是将RNP送入细胞的最有效方法，已在体外基因编辑和小鼠胚胎基因工程中取得成功。而通过静脉注射LNP导入RNP同样有效地将CRISPR组分靶向递送至肌肉、大脑、肺和肝脏。目前，基于RNP的CRISPR疗法已在临床上取得成功，首个基于CRISPR基因编辑的药物Casgevy获得FDA批准，用于治疗镰状细胞贫血。这种药物通过电穿孔将RNP形式的CRISPR组分递送至患者细胞，经过筛选后再回输至患者体内。

在生物医疗领域，随着CRISPR技术的不断发展和应用，人生就是博-尊龙凯时致力于推动这一技术在精准医疗和基因疗法中的前沿探索，期待更多创新带来健康的希望。